野生菌质粒提取注意事项,野生菌质粒提取注意事项有哪些
提取质粒的菌液摇过夜后可以不马上提吗?
当然可以,我在4℃保存过一天,第二天提取,完全没有问题。
提取质粒的方法?
质粒抽提
质粒抽提方法即去除 RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。
提取质粒DNA的方法有很多种,从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取,从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取,从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等,各种不同的方法各有其优缺点,根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。
质粒提取的步骤?
质粒的提取步骤
1. 取通过单克隆过夜培养的新鲜菌1.5-5ml到新EP管,6000-8000rpm离心1-2min,尽量去上清(看菌长的情况怎么样,一般会养多的,所以低速离心,多丢掉点上清乃至混有上清的菌体也没关系,浪费就浪费了);
2. 取冰盒,放入加了适当浓度的RNase酶的P1 buffer,在收集的菌体沉淀中加入250μl的P1 buffer,并用移液枪打匀(低速其实就是为了方便三下就迅速打匀,高速离心有轻微伤害,且打匀稍微费点劲而已);
3. 再加入250μl的P2 buffer,温和地上下颠倒5-10次混匀,会有黏液状出现(像果冻一样,注意不要剧烈震荡混匀,有损伤,且可能导致基因组DNA断裂污染质粒,完全可以不静置,裂解时间长了有损伤);
4. 迅速加入350μl的P3 buffer,再轻柔地上下颠倒5-10次混匀(迅速加P3和速度不要太快的混匀不冲突,剧烈震荡有损伤);
5. 有白色絮状或块状出现,12000rpm离心5-10min(这里可以高速一下,免得吸取上清把蛋白等吸进去了,所以,吸取干净的上清就行,和之前一样,浪费了一些就浪费了,不要执着全吸走,我们要质量高的质粒,而不是要多的质粒);
6. 转移全部上清液到吸附柱,4000-6000rpm离心30s-1min,弃废液(这里最好低速离心,充分让吸附柱吸附,所以看吸附柱情况调整转速和时间);
7. 加入500μl pH=7.5的washing buffer至吸附柱中,4000-6000rpm离心30s-1min,弃废液(同上,低速慢慢洗);
8. 重复7步骤再洗两次,如果要去除盐类,可以停留1-2min再离心(加洗液);
9. 空柱12000rpm离心3-5min(这里一定要高速离心,去掉吸附柱里的残留液体,主要是酒精);
10. 转移吸附柱到1.5ml新EP管,常温或加热开盖放置15-30min,挥发干净剩余酒精(也别太高温或者时间太长,没酒精味道就行);
11. 轻轻加入65℃,40-50μl左右预热的EB buffer或者ddH2O至吸附柱覆膜中央,静置2min,再12000rpm离心30s-1分钟,留清液(一般,我们用去离子水就好了。免得后续质谱什么还收到残留胍盐影响);
用Nano drop 2000 测量DNA含量,符合要求则进行下一步的比如电泳验证,酶切等实验。