野生菌质粒提取注意事项，野生菌质粒提取注意事项有哪些

提取质粒的菌液摇过夜后可以不马上提吗？

当然可以，我在4℃保存过一天，第二天提取，完全没有问题。

提取质粒的方法？

质粒抽提

质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。

质粒提取的步骤？

质粒的提取步骤

1. 取通过单克隆过夜培养的新鲜菌1.5-5ml到新EP管，6000-8000rpm离心1-2min，尽量去上清（看菌长的情况怎么样，一般会养多的，所以低速离心，多丢掉点上清乃至混有上清的菌体也没关系，浪费就浪费了）；

2. 取冰盒，放入加了适当浓度的RNase酶的P1 buffer，在收集的菌体沉淀中加入250μl的P1 buffer，并用移液枪打匀（低速其实就是为了方便三下就迅速打匀，高速离心有轻微伤害，且打匀稍微费点劲而已）；

3. 再加入250μl的P2 buffer，温和地上下颠倒5-10次混匀，会有黏液状出现（像果冻一样，注意不要剧烈震荡混匀，有损伤，且可能导致基因组DNA断裂污染质粒，完全可以不静置，裂解时间长了有损伤）；

4. 迅速加入350μl的P3 buffer，再轻柔地上下颠倒5-10次混匀（迅速加P3和速度不要太快的混匀不冲突，剧烈震荡有损伤）；

5. 有白色絮状或块状出现，12000rpm离心5-10min（这里可以高速一下，免得吸取上清把蛋白等吸进去了，所以，吸取干净的上清就行，和之前一样，浪费了一些就浪费了，不要执着全吸走，我们要质量高的质粒，而不是要多的质粒）；

6. 转移全部上清液到吸附柱，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液（这里最好低速离心，充分让吸附柱吸附，所以看吸附柱情况调整转速和时间）；

7. 加入500μl pH=7.5的washing buffer至吸附柱中，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液（同上，低速慢慢洗）；

8. 重复7步骤再洗两次，如果要去除盐类，可以停留1-2min再离心（加洗液）；

9. 空柱12000rpm离心3-5min（这里一定要高速离心，去掉吸附柱里的残留液体，主要是酒精）；

10. 转移吸附柱到1.5ml新EP管，常温或加热开盖放置15-30min，挥发干净剩余酒精（也别太高温或者时间太长，没酒精味道就行）；

11. 轻轻加入65℃，40-50μl左右预热的EB buffer或者ddH2O至吸附柱覆膜中央，静置2min，再12000rpm离心30s-1分钟，留清液（一般，我们用去离子水就好了。免得后续质谱什么还收到残留胍盐影响）；

用Nano drop 2000 测量DNA含量，符合要求则进行下一步的比如电泳验证，酶切等实验。